NEB無(wú)縫克隆

--同源重組Gibson組裝、Golden Gate 組裝

北京云肽生物科技的美國(guó)進(jìn)口NEB無(wú)縫克隆產(chǎn)品，提供基于同源重組Gibson組裝(吉布森組裝)的NEBuilder高保真無(wú)縫克隆試劑盒(含核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶)，以及基于Golden Gate 組裝(金門(mén)組裝)的NEBridge無(wú)縫克隆試劑盒(BsaI-HFv2、BsmBI-v2)、50種llS型限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連核酶等，支持≤52個(gè)片段的無(wú)縫組裝，具備高組裝效率、高靈活性，支持復(fù)雜DNA片段克隆，為生物實(shí)驗(yàn)分子克隆提供高性能的研究工具。

一、NEBuilder Gibson組裝

NEBuilder無(wú)縫克隆技術(shù)，是對(duì)同源重組技術(shù)(即Gibson組裝、吉布森組裝)的升級(jí)，在待插入片段末端通過(guò)PCR擴(kuò)增添加15~30bp重疊序列，在等溫條件下，通過(guò)5'外切酶消化形成3’突出粘性末端，同源重組互補(bǔ)退火，高保真DNA聚合酶進(jìn)行延伸，高保真DNA連接酶補(bǔ)平缺口，可實(shí)現(xiàn)≤11個(gè)片段的高效無(wú)縫組裝，特別適合單鏈寡核苷酸ssOligo塔橋、文庫(kù)構(gòu)建、微型高通量克隆等應(yīng)用。

NEBuilder擁有>10年的開(kāi)發(fā)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，性能指標(biāo)嚴(yán)格，保證數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)，具備高組裝效率、高保真度，即可解決復(fù)雜的gao端克隆應(yīng)用，也可節(jié)省常規(guī)克隆后續(xù)篩選時(shí)間。

1、不依賴(lài)內(nèi)切酶--只需在多個(gè)片段末端添加重疊序列，僅質(zhì)粒載體線性化時(shí)需要酶切，不受限制性?xún)?nèi)切酶所限，具備更大靈活性。

2、高組裝效率--支持≤11個(gè)片段的無(wú)縫組裝。

3、高保真度--使用高保真DNA聚合酶，即使5'末端、3'末端存在錯(cuò)配，高保真DNA聚合酶可在退火后切割去除錯(cuò)配序列(<10nt)，組裝正確性高，無(wú)需反復(fù)篩選、測(cè)序。

4、兼容性強(qiáng)--支持<100bp片段、>10kb片段、低起始量組裝，可使用合成的單鏈寡核苷酸ss0ligo連接2條雙鏈片段(如插入接頭、gRNA文庫(kù))。

5、方便快速--只需15min、在同一管中即可完成無(wú)縫克隆。

6、設(shè)計(jì)工具--提供NEBuilder在線設(shè)計(jì)軟件，可以方便、快捷地進(jìn)行NEBuilder組裝引物設(shè)計(jì)，以獲得高效率、高正確性的無(wú)縫組裝。

二、NEBridge Golden Gate 組裝

用于無(wú)縫克隆的Golden Gate組裝技術(shù)(金門(mén)組裝技術(shù))，在dSDNA片段兩端通過(guò)PCR擴(kuò)增添加IIS型限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)IIS內(nèi)切酶酶切后，識(shí)別位點(diǎn)被移除，形成互補(bǔ)的4堿基突出末端，再使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，可將多個(gè)DNA片段插入載體中，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)片段

、或多個(gè)片段的克隆，且克隆后無(wú)額外堿基的插入。

NEBridpe Golden Gate組裝試劑，對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行升級(jí)，成功實(shí)現(xiàn)≤52個(gè)片段的高效組裝，提供包括成品Golden Gate 試劑盒、50種IIS型限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶預(yù)混液(添加了連接增強(qiáng)劑)、經(jīng)典T4 DNA 連接酶等產(chǎn)品，幫助研究者快速構(gòu)建重組質(zhì)粒。

以IIS型限制性?xún)?nèi)切酶BSaI-HFv2為例，進(jìn)行Golden Gate 組裝時(shí)，需要在dsDNA片段的兩端加上其識(shí)別位點(diǎn)(GGTCTC)。酶切后，識(shí)別位點(diǎn)被移除，組裝片段末端帶有設(shè)計(jì)好的特定4堿基突出以指導(dǎo)組裝。

1、高組裝效率--支持≤52個(gè)片段的高效組裝，具備非常高的組裝效率和組裝準(zhǔn)確率，其中<30個(gè)片段的組裝效果更佳。

對(duì)于包含12、24、35、52個(gè)片段的Golden Gate 組裝反應(yīng)，顯示了含有正確組裝的菌落百分比。誤差線為至少3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

2、豐富IIS型內(nèi)切酶--NEB提供業(yè)內(nèi)更多的50種IIS型限制性?xún)?nèi)切酶，其中9種酶經(jīng)過(guò)Golden Gate 組裝驗(yàn)證，提供了更多酶切位點(diǎn)選擇，

3、高兼容性--支持高GC含量、高重復(fù)序列、<100bp片段、>15kb片段的復(fù)雜組裝。

4、高保真度--NEB經(jīng)典T4連接酶，通過(guò)高保真末端連接，提高復(fù)雜多片段組裝的正確性(20個(gè)片段組裝正確率>90%);升級(jí)的NEBridge連接酶預(yù)混液，對(duì)緩沖液體系、操作步驟進(jìn)行優(yōu)化，搭配N(xiāo)EB IIS型內(nèi)切酶使用，可進(jìn)一步提高連接效率和保真度。

圖.使用NEBridge連接酶預(yù)混液進(jìn)行24個(gè)片段的Golden Gate 組裝。使用NEBridge連接酶預(yù)混液時(shí)，每微克載體DNA產(chǎn)生2.2±0.2*10⁶個(gè)正確組裝的菌落，保真度為94.3±1%，而使用NEB T4 DNA連接酶緩沖液時(shí)，每微克載體DNA產(chǎn)生8.3±2.1*10⁵個(gè)正確組裝的菌落，保真度為69.8士10.7%。

5、使用靈活--提供Golden Gate組裝試劑盒(Bsa1-HFv2、BsmBI-v2)、50種llS型限制性?xún)?nèi)切酶、NEBridge連接酶預(yù)混液、T4 DNA連接酶等豐富產(chǎn)品形式，供實(shí)驗(yàn)人員靈活使用。

6、操作簡(jiǎn)單--酶切和連接反應(yīng)可在同一管中完成，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。

7. 設(shè)計(jì)工具--探供GoldenGate在線設(shè)計(jì)軟件，可以方便、快捷地進(jìn)行Golden Gate 組裝引物設(shè)計(jì)，通過(guò)預(yù)測(cè)、評(píng)估粘性末端鏈接偏好，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜片段的高保真組裝。

DNA組裝選擇

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